Научные результаты:
Для разработки подходов к созданию новых сортов/линий картофеля, адаптирующихся к изменению климата и его последствиям, был изучен комбинированный эффект, оказываемый вирусной и бактериальной инфекцией и тепловым стрессом на растения картофеля. На начальном этапе проведен фенотипический и физиологический анализ 19 сортов/сортовых линий картофеля из коллекции селекционно-генетического центра OOO «Дока-Генные Технологии» (ООО «ДГТ»), различающихся по степени устойчивости к повышенной температуре, потивирусу Y вирусу картофеля (YВК) и бактерии Clavibacter michiganensis раздельно или совместно подверженных данным стрессам. Для фенотипирования растений картофеля, реагирующих на индивидуальный и комбинированные стрессы, предложены новые подходы, сочетающие классические (физиологические) и молекулярно-биологические, микробиологические и биофизические методы. Обнаружены новые виды взаимодействия между стрессами: (а) вирус-бактерия (интерференция или синергизм), вирус-тепловой стресс (синергизм) и бактерия-тепловой стресс. Полученные данные важны для практического растениеводства и могут быть рекомендованы при районировании сортов картофеля в условиях изменений климата. Показано, что Clavibacter michiganensis распространен в России на растениях картофеля и сахарной свеклы, что подтверждает практическую значимость предложенной модели для изучения и улучшения устойчивости растений картофеля к комбинированным стрессам.
Созданы трансгенные линии картофеля с гиперэкспрессией генов ядерных белков - коилина, поли (АДФрибоза)полимеразы (PARP) и фибрилларинa. Получены модельные растения картофеля с ингибированной методом РНК интерференции экспрессией генов коилина, PARP и фибрилларинa. Показано, что гиперэкспрессия соответствующих генов приводит к повышенной восприимчивости растений картофеля к комбинированным стрессам, а дефицит данных белков - к повышенной устойчивости.
Проведено протеомное профилирование выявленных на начальном этапе контрастных по устойчивости к тепловому стрессу и инфекции вирусом YВК сортов картофеля - сорт Гала (устойчивый) и сорт Чикаго (восприимчивый) на ранних и поздних сроках инфекции. Для изучения количественных изменений в протеомах обоих сортов был использован масс-спектрометрический анализ белков, связанных с метками для относительной и абсолютной квантификации (iTRAQ). Сорт Чикаго продемонстрировал достаточно слабые отклонения в количественном и качественном составе протеома в ответ на индивидуальный и комбинированный стрессы (вирусная инфекция и повышение температуры) по сравнению с сортом Гала. Исследование молекулярных механизмов резистентности к стрессам сорта Гала, проведенное в сравнении с восприимчивым сортом Чикаго, подтвердило результаты протеомного профилирования и показало, что устойчивость растений картофеля к стрессам определяется механизмами, индуцируемыми салициловой кислотой и связанными с белками теплового шока. С использованием дрожжевой двугибридной системы, методов ко-иммунопреципитации и FLIP-FRET выявлены белки, взаимодействующие с ядерными белками фибрилларином и коилином, которые участвуют в ответах растения на биотический и абиотический стрессы. В результате проведенных исследований выявлены белки-кандидаты, обуславливающие устойчивость сорта Гала к различным видам стрессовых факторов: идентифицировано более 10 потенциальных генов-мишеней, контролирующих устойчивость к комбинированным биотическим/абиотическим стрессам. Одним из наиболее значимых выводов является демонстрация взаимодействия классических механизмов устойчивости, опосредованных салициловой кислотой, с новыми неканоническими функциями клеточного ядра, выполняемыми фибрилларином, коилином и PARP.
Одним из ключевых результатов исследований явилось обнаружение новых функциональных связей белков, определяющих уровень устойчивости растений к вирусам и стрессам, с метаболизмом РНК. Методами протеомики было установлено, что синтез белков, участвующих в цикле метилирования РНК (основных ферментов метионинового цикла), осуществляется на высоком уровне в устойчивом к стрессам сорте картофеля и подавлен в восприимчивом сорте картофеля в условиях теплового стресса и вирусной инфекции. Эти данные были подтверждены в дополнительных исследованиях по изучению экспрессии соответствующих генов и уровней основных метаболитов метионинового цикла и метионина в восприимчивом и устойчивом сортах картофеля в условиях комбинированного стресса. Показано, что обработка восприимчивых растений экзогенным метионином повышает резистентность растений картофеля к заражению YВК при повышенной температуре. Таким образом, устойчивость/восприимчивость растений к инфекции YВК в условиях теплового стресса у разных сортов картофеля может регулироваться на уровне метионинового цикла, определяющего эффективность реакций трансметилирования.
С использованием методов трансгенной гиперэкспрессии, дцРНК-индуцируемой РНК интерференции и геномного CRISPR/Cas редактирования показано, что защитная система растения регулируется белками ядрышка – фибрилларином и телец Кахаля - коилином. Ингибирование экспрессии фибрилларина и коилина в растениях картофеля приводит к молекулярным изменениям в сигнальных зависимых от СК защитных путях и усиливает защитную реакцию растения, приводя к устойчивости растений картофеля к стрессам. Результаты, полученные в лабораторных экспериментах, были подтверждены данными испытаний редактированных по гену коилина линий растений картофеля в полевых условиях на естественном инфекционном фоне. Полевые испытания показали, что пониженная экспрессия гена коилина сопровождается более интенсивным ростом и повышенной продуктивностью растений при повышенной устойчивости к заражению YВК. В то же время эти ядерные белки могут дифференцированно влиять на вирусную инфекцию, повышая инфекционность YВК и при этом снижая патогенность вируса погремковости табака (опасный патоген картофеля), что необходимо учитывать при разработке мер защиты от вирусов и стрессов. Эти данные подтверждают предположения о тесном взаимодействии между защитными путями и процессами в клеточном ядре.
Получены трансгенные растения с гиперэкспрессией ядерного белка Rab28, который является одним из ключевых белков, принимающих участие в формировании ответа на воздействие абсцизовой кислоты (АБК). Экспрессия гена Rab28 активируется в ответ на обработку АБК и в растениях, оказавшихся в условиях засухи. Эти трансгенные растения проявили исключительную устойчивость к засухе и устойчивость к вирусной инфекции при нормальной температуре и в условиях теплового стресса. Результаты полевых испытаний этих растений на естественном фоне подтвердили лабораторные данные о заметно повышенной устойчивости трансгенных по гену Rab28 линий картофеля к вирусной инфекции. Однако такая существенная характеристика сельскохозяйственного растения, как продуктивность, оказалась такой же или даже в 2-2,5 раза ниже, чем продуктивность исходного сорта. Таким образом, ген, полезный для одного признака, может ухудшать другие признаки растения. Необратимое изменение экспрессии генов (гиперэкспрессия или напротив выключение экспрессии) методами редактирования по технологии CRISPR-Cas или при создании трансгенных растений осложняет использование таких линий в растениеводстве. В настоящее время усилия и дальнейшие исследования нацелены на разработку методов временной регуляции экспрессии полезных генов на основе механизма РНК-интерференции.
В процессе выполнения проекта было показано, что короткие пептиды, в том числе с ядерной локализацией, играют важную роль в процессах роста и развития растения. В связи с тем, что эти процессы перекрываются с сигнальными путями, обеспечивающими ответы растения на стресс, эти пептиды представляют значительный интерес с точки зрения индукции устойчивости как к индивидуальным, так и к комбинированным биотическим/абиотическим стрессам. В этой связи для тестирования биологически активных пептидов разработаны два метода (получены патенты РФ): 1) система тестирования ростовых и биоактивных соединений на основе культур гаметофоров зеленых мхов; 2) клеточные тест-системы на основе спор зеленых мхов для анализа биологической активности низкомолекулярных соединений.
На заключительном этапе реализации мегагранта проведено мультиплексное секвенирование кодирующих и некодирующих РНК (RNA-seq) из растений картофеля сорта Чикаго, восприимчивого к стрессам, в условиях абиотического (повышенная температура)/биотического (заражение YВК) и комбинированного (YВК и повышенная температура) стрессов. Показано, что индивидуальные и комбинированный (YВК и повышенная температура) стрессы вызывают значительные изменения в экспрессии генов, влияя на транскрипцию как кодирующих белки, так и некодирующих РНК. Среди вновь идентифицированных генов, отвечающих на инфекцию YВК, обнаружены гены, кодирующие ферменты, участвующие в катализе образования полиаминов и полиАДФ рибозилировании. Также идентифицирована серия новых некодирующих РНК, которые дифференциально синтезируются в ответ на индивидуальный или комбинированный стресс и включают антисмысловые РНК и РНК с участками связывания миРНК. Полученные при использовании метода нанопорового секвенирования РНК данные расширили знания о потенциальной роли альтернативного сплайсинга и эпитранскриптомного метилирования РНК в процессе стрессов. Эти результаты предоставляют значительную информацию для будущих исследований функциональных связей между вирусными инфекциями и перепрограммированием транскриптома, метилированием РНК и альтернативным сплайсингом.
Показано, что при активации механизма специфической РНК интерференции, вызванной эндогенным применением дцРНК против YВК, неспецифический защитный ответ по типу иммунитета, индуцируемого патоген-ассоциированными молекулярными паттернами, не проявляется и не способен защитить растение от инфицирования неродственным вирусом. Таким образом, экзогенная дцРНК является высоко специфичным и активным триггером РНК интерференции, обеспечивая высокий уровень «выключения» гомологичного гена, и, следовательно, подобный подход перспективен не только для исследований в области функциональной геномики, но и для применения в практическом растениеводстве.
В настоящее время проводится разработка подходов для создания РНК-ориентированных технологий, основанных на явлении РНК интерференции, которые направлены на защиту растений от патогенов и регуляцию экспрессии генов растений для придания им полезных признаков. Исследования проводятся как на модельных растениях N.benthamiana, так и на растениях картофеля.
Для создания РНК препаратов, направленных против актуальных патогенов (вирусов), заражающих растения картофеля в различных регионах РФ, проведен анализ методом секвенирования нового поколения (NGS) РНК (РНК-сек) листовых и клубневых проб картофеля из различных областей РФ с последующим биоинформатическим поиском консенсусных последовательностей вирусов картофеля, предсказания и синтеза универсальных двуцепочечных РНК против выявленных штаммов вирусов. Противовирусная активность предсказанной и наработанной дцРНК против Y вируса картофеля оценивается в лабораторных опытах на зараженных растениях картофеля.
Проводятся эксперименты по экзогенному использованию препаратов дцРНК, а также искусственных малых РНК против генов фитоен десатуразы и магниевой хелетазы для ингибирования их экспрессии в растениях N.benthamiana с целью создания функциональной модели РНК интерференции генов растения как быстрого визуального теста на эффективность РНК препаратов и условий их доставки в клетки растения.
Внедрение результатов исследования:
Разработанные в ходе выполнения мегагранта технологии и препараты, а также линии картофеля передавались в ООО «ДГТ» для испытаний и внедрения результатов проекта в сельскохозяйственную практику. К переданным результатам исследования относятся:
- Генно-инженерные конструкции и препараты двуцепочечной РНК для ингибирования на основе механизма РНК интерференции репродукции ряда вирусов растений;
- Технология получения двуцепочечной РНК против вирусов растений;
- Линии трансгенных растений с гиперэкспрессией генов коилина и Rab28;
- Линии картофеля, редактированные по гену коилина с помощью технологии CRISPR/Cas.
Образование и переподготовка кадров:
- Разработаны и находятся в процессе разработки курсы лекций по программе «Биотехнология растений».
-
Проведены стажировки аспирантов и молодых ученых в Институте Джеймса Хаттона (Великобритания).
-
Члены научного коллектива лаборатории приняли участие в организации Картофельного Форума России, а также выступили на нем с докладами (ООО «Дока-Генные Технологии», с. Рогачёво, Московская область, август 2018 г.). Мероприятие было проведенно совместно с представителями Российской академии наук, Минобрнауки России и Администрации Президента России. На Форуме была доложена программа внедрения результатов реализации мегагранта в сельскохозяйственную практику.
-
По итогам выполнения мегагранта организован и проведен симпозиум (конференция) «Молекулярные механизмы устойчивости растений к экологическим стрессам и болезням» (ноябрь 2020 г.), на котором выступили члены научного коллектива лаборатории и приглашенные докладчики.
-
Подготовлены и защищены 3 кандидатские диссертации.
Сотрудничество:
- Институт Джеймса Хаттона (Великобритания): совместные исследования и публикации, стажировки сотрудников.
-
ООО «Дока-Генные Технологии» (Россия): софинансирование мегагранта. Разработанные в ходе выполнения мегагранта технологии и препараты, а также линии картофеля передавались в ООО «ДГТ» для испытаний и внедрения результатов проекта в сельскохозяйственную практику. Сотрудники ООО «ДГТ» являются соавторами ряда публикаций по мегагранту.
