Научно-производственный биотехнологический комплекс для проведения работ по изучению, сохранению и практическому применению культивируемых клеток и органов высших растений и микроводорослей

Научные результаты:

Был создан научно-производственный комплекс полного цикла на основе разработки природосберегающей Hi-Tech биотехнологии получения высококачественного продукта фармацевтического и пищевого назначения с использованием культивируемых клеток и органов высших растений и микроводорослей. Комплекс по совокупности параметров является уникальной импортозамещающей платформой для промышленного получения биопрепаратов с заданными свойствами независимо от условий внешней среды. Характеристики имеющегося технологического оборудования позволяют при масштабировании лабораторных разработок создавать экологически безопасную и экономически выгодную производственную схему от получения штаммов-продуцентов до их культивирования в промышленных объемах с возможностью последующей оценки качества и функционального действия получаемого продукта.

В частности, получены новые стабильно растущие in vitro каллусные и суспензионные культуры лекарственных растений рода Fabaceae, Alhagi persarum и Sutherlandia frutescens, для экстрактов которых показано антибактриальное действие против Staphylococcus aureus. Для культуры клеток A. persarum разработано выращивание в лабораторном 20-ти литровом барботажном биореакторе. Для ранее полученной культуры клеток живучки туркестанской, Ajuga turkestanica, выращиваемой в колбах и биореакторах, показаны присутствие туркестерона, экдистерона и других экдистероидов, а также фенилэтаноидов.

Разработано аппаратное выращивание суспензионных культур клеток лекарственных растений Polyscias filicifolia и P. fruticosa и показано присутствие в клеточной биомассе пяти тритерпеновых гликозидов с олеаноловой кислотой в качестве агликона. Культуры клеток Panax japonicus и Polyscias fruticosа при выращивании в колбах и барботажных биореакторах синтезируют богатую смесь тритерпеновых гликозидов со значительным содержанием гинзенозида R0 (13.8 мг/г сухого веса (СВ).

Разработана и оптимизирована схема масштабирования выращивания суспензионных культур клеток Dioscorea deltoidea, Taxus wallichiana, P. japonicus и P. filicifolia в отъемно-доливном режиме в барботажных биореакторах до промышленных объемов в линейке 20 л–75 л–630 л c выходом 9.00-12.00 гСВ/л среды и стабильным накоплением целевых биологически активных веществ. Элиситация культуры T. wallichiana метилжасмонатом приводила к появлению таксоидов С13-ОН группы, к которой относится паклитаксел.

Получены и в настоящий момент поддерживаются 11 линий адвентивных корней 11 видов растений – потенциальные продуценты биологически активных веществ.

Показано, что штаммы микроводорослей Dunaliella salina IPPAS D-294 и Scenedesmus rubescens IPPAS D-292 обладают высокими ростовыми характеристиками, а штамм IPPAS D-292, кроме этого – высокой продуктивностью. Оба штамма способны запасать большое количество крахмала и могут накапливать каротиноиды. Штамм IPPAS D-292 кроме этого может переходить к накоплению липидов на поздних стадиях роста.

Оптимизированы условия и подобраны режимы выращивания микроводорослей штамма Chlorella sorokiniana IPPAS C-1 в лабораторных биореакторах при различных значениях освещенности, концентрации CO₂ и температурах. Наиболее высокие ростовые показатели (2.78 гСВ/л) достигнуты при 30–32 ºС и 1.5–3% CO₂ за 9 сут культивирования. Общий урожай составил 194.6 гСВ. При оптимизации полупроточного и комбинированного выращивания в биореакторах общий урожай составил 163.62 гСВ за 16 сут культивирования. Также успешно осуществлено выращивание штаммов C. vulgaris IPPAS C-2 и P. kessleri IPPAS C-9 в периодическом режиме в фотобиореакторе ПГ-5.

Разработан и оптимизирован процесс масштабирования выращивания отобранных штаммов-продуцентов микроводорослей в фотобиореакторах в линейке фотобиореакторов от 0,25 л до 100 л, разработанных в ИФР РАН. На установках проведен комплекс экспериментов по культивированию Chlorella sorokiniana IPPAS С-1, C. vulgaris IPPAS C-2 и Parachlorella kessleri IPPAS C-9 в различных условиях. В целом, за десятидневный цикл периодического культивирования с переходом от 250 мл до 70 л было получено увеличение биомассы в 168 раз.

Разработаны способы обработки и хранения получаемого сырья микроводорослей для разных целей. Хранение пасты, полученной в результате концентрирования биомассы, при -20 °С признано наиболее эффективным для длительного хранения. Хранение суспензии водорослей при сниженном освещении является более экономически выгодным, при этом сохраняется максимальная жизнеспособность клеток.

Полученные в результате работ по Мегагранту результаты можно рассматривать как готовые к внедрению на производствах импортозамещающие разработки для получения функциональных продуктов питания, кормов и кормовых добавок, ингредиентов для косметических и фармацевтических препаратов.

Внедрение результатов исследования:

На основании результатов проведенных работ составлены предварительные рекомендации по изготовлению и использованию фармацевтических субстанций в виде водных суспензий из клеточной биомассы Dioscorea deltoidea, Tribulus terrestris и Panax spp., полученной биотехнологическим способом, для профилактики и коррекции нарушений липидного и углеводного обмена человека. Составлены Проекты опытно-промышленных регламентов получения клеточной биомассы отобранных штаммов глубинным способом в биореакторах. Полученные при выполнении проекта данные послужат обоснованием для последующего внедрения в фармацевтическую промышленность результатов фундаментальных исследований в части разработки инновационных лекарственных средств для профилактики и лечения патологий, связанных с нарушениями липидного и углеводного обмена (атеросклероза и сахарного диабета), на основе культур клеток диоскореи дельтовидной, якорцев стелющихся и женьшеня японского.

Результаты проведенных НИР используются в работе OOO «Химико-биологическое объединение «Фирма ВИТА»» и Компании «BioPharmos Group».

Образование и переподготовка кадров:

Разработаны две образовательные программы для подготовки высокопрофессиональных научных и инженерно-технических кадров по темам: «Биобанкирование культур клеток, культур органов высших растений и микроводорослей» (в двух частях), «Биология клетки с основами промышленной фитобиотехнологии» (в двух частях). Программы были апробированы в рамках функционирования Филиала кафедры физиологии растений биологического факультета МГУ имени М.В.Ломоносова с магистрами биологического факультета.

Сотрудничество:

• Кафедра физиологии растений и кафедра биоинженерии биологического факультета МГУ имени М.В.Ломоносова, Федеральный научный центр пищевых систем им. В.М. Горбатова Российской академии наук, Санкт-Петербургский государственный химико-фармацевтический университет Министерства здравоохранения Российской Федерации, ООО «БИОФАРМОС» (Компания «BioPharmos Group»), ООО «Химико-биологическое объединение «Фирма ВИТА» (Россия).
  

Результаты совместной работы:

1. Проведены работы по анализу макро- и микроэлементного состава наработанной при выращивании в биореакторах биомассы культур клеток Panax ginseng и Polyscias filicifolia методом масс-спектрометрии с индуктивно связанной плазмой (ИСП-МС). Установлено наличие в биомассе обеих культур клеток всех жизненно важных макро- и микро-элементов в биомассе суспензионной культуры клеток обоих видов. Полученные данные позволяют характеризовать биомассу клеток женьшеня японского и полисциаса папортниколистного как экологически чистое растительное сырье и рекомендовать ее для использования в функциональных продуктах питания и кормах.
2. Показана высокая антиоксидантная активность для образцов биомассы культур клеток 7 видов, Polyscias fruticosa P.  filicifoliа, Panax vietnamensis P. japonicus, Ajuga turkestanica, Dioscorea deltoidei и Tribulus terrestris, выращиваемых в НП комплексе ИФР РАН методом культивирования в биореакторах. Наибольшие значения AOA для образов культур клеток зафиксированы для культур женьшеня вьетнамского, полисциаса папоротниколистного и якорцев стелющихся. Значения АОА для этих культур сравнимы или превышают таковые у культур клеток, уже использующихся в коммерческом производстве косметической продукции. Высокая АОА позволяет говорить о высокой перспективности данных культур для применения в пищевой и косметической промышленности.
3. Разработана биологическая тест-система на основе ракообразных D. magna для быстрого скрининга токсичности культур клеток высших растений, получаемых биотехнологическим способом.
4. Совместно с МГУ имени М.В. Ломоносова продолжены работы по созданию инновационных полимерных материалов на основе хитозана и биомассы суспензионных культур клеток растений. Синтезирован гибридный полимерный поликатионный материал на основе хитозана с молекулярной массой 600 кДа и биомассы клеток Ajuga turkestanica и Polyscias fruticosa. Показано, что новый материал c добавлением биомассы клеток A. turkestanica имеет большую площадь поверхности по сравнению с хитозаном и в течение 1 часа практически полностью сорбирует из среды клетки модельных микроводорослей.
5. Совместно с СПХФУ Минздрава России проведены работы по определению острой пероральной токсичности и оценке антигипоксического действия водных суспензий из наработанных в биореакторах образцов клеточной биомассы диоскореи дельтовидной, якорцев стелющихся, женьшеня японского. По результатам исследований образцы отнесены к классу токсичности «5 класс токсичности или не классифицируется». Также для исследуемых субстанций (водных суспензий) показано антигипоксическое действие, наиболее выраженное – для якорцев стелющихся и диоскореи дельтовидной.
6. Проведены исследования гипогликемических свойств фитопрепаратов на основе женьшеня, диоскореи и якорцев. Показана эффективность применения фитопрепаратов на основе диоскореи и якорцев при сахарном диабете СД 2 у крыс, основанная на снижающихся показателях уровня глюкозы крови, мочи, суточного диуреза и улучшения ОХС сыворотки крови. Снижение показателей углеводного и липидного обмена сопоставимы с действием референсного препарата (метформина). Водные экстракты культур клеток диоскореи, якорцев и женьшеня также показали гипохолестеринемическую активность у животных с ожирением. По итогам проведенной работы наиболее эффективным фитопрепаратом, обладающим гипохолестеринемическим и гипогликемическим действиями, показан экстракт культур клеток Dioscorea deltoidea.

• Sunchon National University (Республика Корея): разработана и в данный момент тестируется система длительного хранения для генетической базы дикорастущих и редких лекарственных растений.

• Chungbuk National University (Республика Корея): получены культуры адвентивных корней для ряда видов лекарственных растений, включая Digitalis lanata, Polyscias filicifolia, Polyscias scutellaria, Polyscias balfouriana, Maackia amurensis. В данное время проводится комплексная оценка полученных культур как потенциальных продуцентов биологически активных веществ, характерных для данных видов.