Лаборатория эпигенетики

Научные результаты:

• Организованы колонии P. citri и S. coprophila в Новосибирском государственном университете (Россия). Линии P. citri привезены из Университета Тосканы (Италия) и из Университета Эдинбурга (Великобритания). В лаборатории эпигенетики созданы все условия для содержания и размножения P. citri, получена устойчивая колония, обеспечивающая достаточное количество биологического материала для проведения экспериментов. Линии S. coprophila привезены из Университета Эдинбурга (Великобритания) и получены из Брауновского университета (США). В настоящее время в коллекции поддерживается 7 линий S. coprophila, несущих различные генетические маркеры и хромосомные перестройки, необходимые для работы.
• Для получения фрагментов генов деметилаз H3K9 и генов метилаз Н3К9 и Н4К20 проведен биоинформатический поиск в черновой сборке генома P. citri гомологов соответствующих генов у Drosophila melanogaster. В результате для каждого гена Drosophila melanogaster было обнаружено от 1 до 5 гомологов в геноме P. citri. Получение фрагментов генов для дальнейшего получения двуцепочечных РНК проводили при помощи специфических праймеров, несущих на 5’ концах последовательности промотора РНК-полимеразы фага T7. В качестве матрицы для ПЦР была использована геномная ДНК P. citri или препарат кДНК, приготовленный из тотальной РНК взрослых самок. Полученные фрагменты клонированы в плазмидные векторы и верифицированы секвенированием. Аналогичная работа проведена для S. coprophila. В результате получены фрагменты генов деметилаз H3K9 и генов метилаз Н3К9 и Н4К20 из двух модельных организмов, подготовленные для получения препаратов дцРНК для последующего проведения РНК-интерференции.
• Привезена из клиники Шаритэ (Берлин, Германия) культура эмбриональных стволовых клеток мыши, в которых гены, колирующие HP1beta и HP1gamma, окружены LoxP-сайтами. Кодирующие последовательности этих генов можно удалить с помощью транзиентной трансфекции конструкцией, экспрессирующей рекомбиназу Cre. По плану работ предполагается исследовать эффект от удаления всех паралогов HP1 на метилирование дифференциально метилированных участков ДНК в локусах контроля импринтинга. Таким образом, перед началом экспериментов требовалось удалить ген CBX5, кодирующий белок HP1alpha. Ранее было показано, что удаление этого белка не оказывает влияния на жизнеспособность ЭСК мыши. Для удаления гена CBX5 был применен метод с использованием системы CRISPR/Cas9. Для этого были приготовлены и протестированы на специфичность направляющие РНК, сайты распознавания которых расположены по бокам от кодирующей части гена CBX5. После того как их эффективность была проверена в тестовой системе, была проведена котрансфекция конструкций, экспрессирующих эти направляющие РНК, и конструкции, экспрессирующей нуклеазу Cas9. В результате активности Cas9 ожидалось получение клонов клеток, в которых кодирующая последовательность гена CBX5 удалена в обоих гомологах хромосом. После трансфекции были отобраны 87 клонов, которые проверяли с помощью ПЦР на наличие 13 т.п.н. делеции, которая приводит к полному удалению кодирующей части CBX5. По результатам ПЦР были обнаружены 4 клона, несущие искомую делецию на обоих гомологах хромосом. Наличие делеции было подтверждено секвенированием. Чтобы исключить вероятность транслокации гена CBX5 в результате хромосомной перестройки в полученных клонах была измерена экспрессия гена CBX5 с помощью количественной ПЦР. Во всех 4 клонах экспрессия гена CBX5 не детектировалась.
• Дальнейшая работа по этому направлению связана с определением уровня метилирования ДНК в локусах контроля импринтинга методами COBRA и бисульфитного секвенирования. Для проведения этих методов были подобраны праймеры для ПЦР, перекрывающие районы метилирования 4 модельных локусов, выбранных для дальнейшей работы.

Организационные и инфраструктурные преобразования:

Создана учебная лаборатория для студентов кафедры цитологии и генетики и кафедры молекулярной биологии факультета естественных наук Новосибирского государственного университета (Россия).

Образование и переподготовка кадров:

Организована стажировка в лаборатории для 5 аспирантов и 8 студентов.

Сотрудничество:

• Эдинбургский университет (Великобритания): освоены методы работы с модельными организмами Plannococcus citri и Sciara coprophila, проведены научные стажировки.

• Институт клеточной биологии и нейробиологии университетской клиники Шаритэ (Германия): освоены методы работы с эмбриональными стволовыми клетками мыши, проведены научные стажировки.

• RIKEN (Япония): охарактеризовано эпигенетическое состояние и уровень экспрессии импринтированных локусов в эмбриональных стволовых клетках мыши после удаления генов, кодирующих белки семейства HP1.

• Университет Тосканы (Италия): проведение экспериментов по РНК-интерференции генов, кодирующих гетерохроматиновые факторы, в эмбрионах Plannococcus citri.

• Университет Антверпена (Бельгия): методами геномной инженерии с использованием CRISPR получены новые клеточные линии, необходимые для дальнейших исследований.